Une endotoxine est un type de pyrogène qui provoque de la fièvre. C'est un composant de la paroi cellulaire des bactéries à Gram négatif comme E.Coli. Les endotoxines sont naturellement présentes sur notre peau, dans nos intestins, dans l'eau et dans de nombreuses autres matières. Cependant, lorsqu'elles passent dans la circulation sanguine, elles provoquent une inflammation et une réaction pyrogène (fièvre). Si elles restent présentes durablement, que ce soit à la suite d'une infection sanguine par des bactéries à Gram négatif ou comme contaminant introduit par le biais de médicaments injectés ou de dispositifs médicaux implantés, les endotoxines peuvent provoquer un sepsis voire la mort. La recherche précise et fiable d'endotoxines dans les produits pharmaceutiques parentéraux et les dispositifs médicaux est donc un test de contrôle qualité essentiel afin de garantir leur sécurité pour l'usage humain. 

Avant l'introduction du rFC, deux méthodes étaient couramment utilisées pour les tests de détection des endotoxines : le test in vivo de recherche des pyrogènes chez le lapin (rabbit pyrogen test, RPT) et le test « lysat d'amoebocytes de limule » (LAL) qui utilise du sang prélevé sur des limules. Ces deux méthodes reposent sur l'utilisation d'animaux et présentent d'autres limites et inconvénients.

Le RPT ne peut fournir que des résultats qualitatifs, possède une sensibilité variable aux endotoxines et peut donner des résultats erronés. Bien que le test LAL soit quantitatif, sa sensibilité et sa spécificité pour les endotoxines varient d'un lot à l'autre et il n'existe pas de méthodologie normalisée pour le traitement des essais. La présence de β glucane dans les échantillons de test et d'autres protéines non spécifiques dans le test LAL peut également fausser les résultats des tests, augmentant ainsi le risque de faux positifs et de résultats positifs erronés pour les endotoxines.

Lors de nos recherches pour la mise au point d'une nouvelle méthode de tests de détection des endotoxines, nous avons cherché à supprimer ces limites tout en étant guidés par la volonté de mettre un terme à la menace pour la survie de la limule : un des principaux facteurs de l'augmentation du risque est la surexploitation pour la production du test LAL. 

Les endotoxines activent le facteur C qui déclenche la réaction en cascade de coagulation du sang de limule qui constitue la base du test LAL. Par conséquent, le facteur C constitue une cible idéale qui pourrait servir de base à une nouvelle méthode de dépistage des endotoxines. En clonant le facteur C, nous pourrions produire un facteur C recombinant synthétique (rFC) stable, évolutif, sûr, durable et efficace. Une source de rFC obtenue par génie génétique garantit un approvisionnement perpétuel en matières qui ne sont pas d'origine animale pour les tests de détection des endotoxines, à partir du clone de rFC. Exprimé à partir d'un seul clone génétique sélectionné, le rFC fournit un test invariable, très sensible et spécifique des endotoxines, avec une capacité de traitement élevée pour l'assurance qualité du processus de fabrication des médicaments, de l'analyse de l'eau et des matières premières en interne jusqu'au produit pharmaceutique final.

La mise au point du rFC a transformé le mode de réalisation des tests de détection des endotoxines en les rendant plus simples, plus précis et plus robustes. Alors que le test LAL implique une cascade de coagulation de plusieurs enzymes dans laquelle chaque membre active le suivant dans la série, le rFC seul est suffisant et invariable en tant que test enzymatique unique. Cela signifie que le contrôle qualité du kit de test de détection des endotoxines utilisant le rFC est plus simple que celui des kits de test utilisant le LAL. Le test rFC est également très facile à adopter car le déroulement des opérations des tests utilisant le rFC est voisin de celui des tests utilisant le LAL. En outre, la plupart des laboratoires qui emploient des tests utilisant la méthode LAL sont déjà équipés des installations nécessaires à l'analyse.

Grâce à l'utilisation du rFC, le test de détection des endotoxines est plus efficace, standardisé, intégré et d'un bon rapport coût-efficacité, ce qui garantit la qualité et la sécurité des produits pharmaceutiques et des dispositifs médicaux à usage parentéral. Un nombre croissant d'études démontrent également le rôle précieux du rFC dans les tests de détection des endotoxines, rôle qui est de plus en plus reconnu par les organismes chargés de la réglementation. Point encourageant : en 2021, la Pharmacopée européenne a accepté et approuvé le rFC au chapitre Ph. Eur. 2.6.32, permettant ainsi son utilisation par les fabricants de produits pharmaceutiques de 39 pays européens. En outre, la Commission européenne de pharmacopée a conforté l'acceptation du rFC en approuvant les révisions destinées à inclure ce test dans plusieurs monographies. Plus récemment, les tests avec le rFC ont été inclus dans la pharmacopée britannique publiée en janvier 2024 et, en juillet 2024, le comité d'experts en microbiologie de la Pharmacopée américaine a voté en faveur de l'inclusion d'un nouveau chapitre <86> dans la Pharmacopée américaine qui autorise les réactifs d'origine non animale pour les tests de détection des endotoxines, notamment le rFC et les réactifs en cascade recombinants (rCR). Le chapitre <86> donne aux fabricants les informations nécessaires à l'utilisation de réactifs d'origine non animale pour les tests de détection des endotoxines. 

L'intérêt global du rFC comme solution pour les tests de détection des endotoxines est un sujet que j'aborderai en détail lors d'un webinaire avec bioMérieux. 

À l'avenir, nous pourrions envisager d'étendre les tests utilisant le rFC à la détection in situ des endotoxines ou de bactéries à Gram négatif vivantes sur des matières solides. Alors que les rCR, composés de trois protéines recombinantes de la cascade LAL (rFC, rFB et enzyme rProclotting) sont en cours d'étude, il est impératif de tenir compte des conséquences pratiques. Du point de vue de la chaîne logistique, le rFC permet de simplifier, de réduire l'impact environnemental et d'améliorer la durabilité, grâce à la baisse de la production et de la gestion des réactifs essentiels. En tant qu'enzyme unique, le kit de test rFC nécessite un seul contrôle qualité et garantit un processus de production plus fiable et rationalisé ; ainsi, le rFC est un choix plus efficace et plus durable pour les tests de détection des endotoxines. En outre, nous pourrions assister à l'apparition de nouvelles formes et de nouvelles plates-formes de traitement des essais rFC et rCR. 

Il est très encourageant de voir davantage de sociétés importantes dans le domaine des tests microbiologiques favoriser activement l'adoption de formes plus durables et éthiques de tests de détection des endotoxines. Une de ces sociétés est bioMérieux, experte en tests de microbiologie industrielle qui s'est fortement impliquée dans les tests de détection des endotoxines utilisant le rFC seul, sans prélèvement parallèle de limules ni achat de sang pour la production de LAL. Cette orientation a permis à bioMérieux de se distinguer en continuant à développer des méthodes créatives et innovantes de détection des endotoxines avec le rFC. Elle témoigne également de ses références en matière de développement durable et de son engagement en faveur de pratiques éthiques. 

Il est important que la communauté scientifique comprenne et reconnaisse les conséquences de notre recours excessif aux LAL pour les tests de détection des endotoxines, non seulement pour les limules mais aussi pour l'environnement au sens large. Dans la région Asie-Pacifique, la limule est aujourd'hui considérée comme une espèce en voie de disparition et les effets des activités humaines sur son habitat ont entraîné la disparition totale d’espèces dans certaines zones. Les répercussions de la diminution des populations de limules sont également préoccupantes car d'autres espèces de l'écosystème se nourrissent de leurs œufs. Si nous disposons d'une solution permettant d'éviter de mettre ces espèces en danger et de réduire notre impact environnemental, nous devons assurément la mettre en œuvre.

En outre, d'un point de vue pratique, l'utilisation du LAL pour les tests de détection des endotoxines expose les sociétés aux conséquences d'une perturbation de leur approvisionnement : par exemple, une catastrophe naturelle pourrait avoir des conséquences négatives sur l'habitat fragile, avec la perte de la population restante de limules, et pourrait perturber des chaînes logistiques entières.

Il y a plus de 50 ans, le principe des 3R (replacement, reduction, refinement) a été défini comme cadre éthique pour la recherche sur les animaux, encourageant le remplacement, la réduction et le perfectionnement des tests utilisant des animaux. La mise au point du rFC est une illustration concrète de ces principes et a offert la possibilité de ne plus recourir aux méthodes faisant appel aux animaux pour les tests de détection des endotoxines. Nous restons optimistes et pensons que le vent est en train de tourner grâce à une plus grande reconnaissance des protéines recombinantes en tant que méthode de choix pour les tests de détection des endotoxines. Avec une adoption plus large du rFC, les tests de détection des endotoxines peuvent devenir totalement durables et éthiques, contribuant ainsi à la préservation des espèces vulnérables et menacées et à l'avenir de notre planète.